在生命科学、药物研发等前沿领域，样本常常珍贵如金，体积微乎其微。传统分光光度计动辄需要数百微升的样本，已然无法满足需求。此时，超微量分光光度计应运而生，它仅需0.5-2μL的样本，便能快速、精准地完成核酸、蛋白质等物质的定量与纯度分析。那么，这台精密的仪器是如何工作的呢？让我们深入其内部，一探从光吸收到数据输出的完整流程。
核心原理：朗伯-比尔定律
超微量分光光度计的理论基石与经典仪器无异，即朗伯-比尔定律。该定律指出，当一束平行单色光通过均匀、非散射的溶液时，溶液的吸光度（A）与溶液的浓度（c）、光程（l）成正比。其数学表达式为：A=εcl。其中，ε是物质的摩尔吸光系数，一个与物质本身及波长相关的常数。
理解这个公式是理解一切的基础：仪器通过测量样本的吸光度（A），在已知光程（l）和吸光系数（ε）的情况下，就能精确计算出样本的浓度（c）。
工作流程详解：从一束光到一组数据
第一步：样本加载与液柱形成
与传统仪器使用比色皿不同，超微量技术的关键在于微体积样本的呈现方式。用户使用专用的加样器，将0.5-2μL的待测样本点位于一个特殊的检测基座上。通过上下基座的闭合与分离，样本在两者之间依靠液体的表面张力，形成一个稳定的悬柱液膜。这个液柱的厚度，即为光通过样本的实际光程。超微量仪器的光程极短，通常在0.2mm到1mm之间，这正是在极低浓度下仍能保持吸光度值在线性范围内的关键，避免了传统长光程（通常1cm）下高浓度样本需要过度稀释的问题。
第二步：全光谱光源与单色化
仪器启动后，内置的氙闪光灯或脉冲式钨灯会发出一束覆盖紫外和可见光区的全光谱复合光。这束光首先通过一个精密的光栅。光栅如同一个高效的“分光棱镜”，可以将复合光色散成连续不断的不同波长的单色光。通过控制光栅的旋转角度，系统能够精准地筛选出特定波长（例如，用于测核酸的260nm或测蛋白的280nm）的单色光，并将其导向样本。
第三步：穿过样本与光的吸收
经过调制的单色光，通过精密的光路系统，垂直穿过之前形成的悬柱液膜。样本中的待测物质（如DNA的碱基、蛋白质的芳香族氨基酸）会选择性地吸收特定波长的光。例如，DNA在260nm处有最大吸收峰。被吸收的光子能量使得分子发生能级跃迁，从而导致透射过样本的光强度减弱。
第四步：信号检测与参考比对
穿过样本的透射光被一个高灵敏度的检测器（如CCD或光电二极管）捕获。检测器将光信号转换为微弱的电信号。这里有一个精妙的设计：在测量样本之前，仪器会先用一个空白对照（通常是同样体积的缓冲液或水）进行同样的测量，记录下初始光强度（I₀）。测量样本时，记录的是透射光强度（I）。根据吸光度的定义A=log₁₀(I₀/I)，仪器内部的微处理器可以瞬间计算出样本在特定波长下的准确吸光度值。
第五步：数据计算与结果输出
这是将物理信号转化为化学信息的最后一步。微处理器根据预设的程序和算法进行一系列复杂的运算：
1.浓度计算：对于DNA，系统会调用其已知的吸光系数（例如，dsDNA的ε为50ng/μL/cm），并结合实际测量的极短光程，通过A=εcl公式变形为c=A/(ε×l)，直接计算出浓度（ng/μL）。
2.纯度评估：系统会读取样本在多个特征波长下的吸光度。例如，通过计算A260/A280和A260/A230的比值，来判断核酸样本中是否残留有蛋白质、酚类或盐离子等污染物。
3.光谱扫描与质量判断：在光谱扫描模式下，光栅会连续扫描一段波长范围（如220nm-700nm），绘制出完整的吸收光谱图。光谱的峰形、平滑度可以帮助判断样本的降解情况或是否存在异常物质。
最终，所有这些处理后的信息——包括浓度、纯度比值、吸光度值以及光谱图——都会被清晰地呈现在仪器的触摸屏或连接的电脑软件上，完成一次完整的分析。
