1665年牛顿做了一个实验，在这个试验中，牛顿使用了分光光度法：他让太阳光透过暗室窗上的小圆孔，在室内形成很细的太阳光束，该光束经棱镜色散后，在墙壁上呈现红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫的色带。这色带就称为“光谱”。牛顿通过这个实验，揭示了太阳光是复合光的事实。1815年夫琅和费仔细观察了太阳光谱，发现太阳光谱中有600多条暗线，并且对主要的8条暗线标以A、B、C、D、E、F、G、H符号。这是人们zui早知道的吸收光谱线，被称为“夫琅和费线”，但当时对这些线还不能做出正确的解释。1859年本森和基尔霍夫发现由食盐发出的黄色谱线的波长和“夫琅和费线”中的D线波长*一致，才知道一种物质所发射的波长（或频率），与它所能吸收的波长（或频率）是一致的。1862年密勒应用石英摄谱仪测定了100多种物质的紫外吸收光谱。他把光谱图表从可见区拓展到了紫外区，并指出吸收光谱不仅与组成物质的基因有关，而且与分子和原子的性质有关。此后，哈托莱和贝利等人又研究了各种溶液对不同波段的截止波长。并发现与吸收光谱相似的有机物，它们的结构也相似。并且可以解释用化学方法所不能说明的分子结构问题，初步建立了分光光度法的理论基础，以此推动了分光光度计的发展。1918年美国国家标准局研制成了世界上*台紫外可见分光光度计，此后，分光光度计得到了发展，并且很快在各个领域的分析工作中得到了应用。

　　
　　分光光度计的工作原理主要是基于朗伯-比耳定律。18世纪初，琅伯在前人的基础上，进一步研究了物质对光的吸收与物质厚度的关系，并于1760年指出：如果溶液的浓度一定，则光对物质的吸收程度与它通过的溶液厚度成正比，这就是朗伯定律，其数学表达式为：
　　
　　A=lgI。/I=K。b
　　
　　式中，A为吸光度；I。为入射光强度；I为透射光强度；b为液层厚度（即光程）；K。为比例常数。
　　
　　1852年，比耳研究了各种无机盐的水溶液对红光的吸收后指出：光的吸收和光所遇到的吸光度的数量有关；如果吸光物质于不吸光的溶剂中，则吸光度和吸光物质的浓度成正比，这就是比耳定律，其数学表达式为：
　　
　　A=lgI。/I=K1C
　　
　　式中，A为吸光度；I。为入射光强度；I为透射光强度；C为溶液的浓度；K1为比例常数。
　　
　　将朗伯定律和比耳定律结合起来，则为朗伯-比耳定律，公式如下：
　　
　　A=lgI。/I=K2bC
　　
　　式中，A为吸光度；I。为入射光强度；I为透射光强度；C为溶液的浓度；b为液层厚度（即光程）；K2为比例常数。

　　
　　朗伯-比耳定律认为：当一束光平行的单色光通过某一均匀的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的乘积成正比，这就是朗伯-比耳定律的真正物理意义，它是光度分析中定量分析的zui基础、zui根本的依据，也是紫外可见分光光度计的基本原理。
　　
　　分光光度计正是根据朗伯-比耳定律，对物质进行定量和定性分析的。