以下是关于超微量分光光度计校准方式的详细解析，涵盖核心步骤、技术要点及注意事项：
一、仪器自校准功能
1. 原理与目的
超微量分光光度计通常内置自校准程序，通过仪器自带的标准参数(如暗电流校正、光源强度补偿)对光学系统进行初始化标定。自校准可快速修正电子漂移、光源老化等引起的偏差，是日常维护的基础步骤。
2. 操作步骤
- 进入仪器菜单，选择“自校准”或“性能验证”模式；
- 按提示执行空白测量(如空气或纯水作为参比)；
- 仪器自动调整至出厂预设参数，并生成校准报告。
3. 局限性
自校准无法纠正波长偏移或光路物理变化(如光纤位移)，需结合其他方法定期验证。
二、外部标准溶液校准
1. 适用场景
当仪器用于定量分析(如核酸、蛋白浓度测定)时，需通过标准溶液验证吸光度准确性。常用标准物质包括：
- 霍姆斯缓冲液(Horseradish Peroxidase, HRP)：用于紫外区(230 nm、260 nm、280 nm)校准；
- 中性密度滤光片：验证吸光度线性范围(0-4 OD)；
- NIST追溯标准溶液(如重铬酸钾溶液)：用于多波长交叉验证。
2. 操作要点
- 液柱形成：超微量仪依赖基座检测模式，需用移液枪精确滴加0.3-2 μL标准液，形成稳定液柱(光程0.05-0.5 mm)；
- 多点校准：在目标波长(如260 nm测RNA)下测量不同浓度标准品，绘制标准曲线，计算仪器线性相关系数(R²>0.995为合格)；
- 空白对照：使用同批次溶剂(如超纯水)作为参比，避免溶剂杂质干扰。
三、波长校准
1. 必要性
波长准确性直接影响定性分析(如特征吸收峰识别)。超微量仪的氙灯光源或LED光源可能发生波长漂移，需定期校验。
2. 校准方法
- 汞灯特征谱线法：利用汞灯在253.6 nm、296.7 nm等处的尖锐吸收峰，对比仪器显示波长与实际峰值偏差(应<±1 nm)；
- Horia溶液法：通过钬玻璃在可见光区的多条特征吸收峰(如486 nm、536 nm)进行多点校准；
- 软件校准：部分机型支持自动扫描标准滤光片，通过算法修正波长偏移。
四、稳定性与重复性检测
1. 短期稳定性
- 连续测量同一标准样品(如1 mg/mL BSA溶液)至少6次，记录吸光度值(如280 nm下误差应<±0.005 OD)；
- 检查基线噪声(通常要求<0.002 OD)以评估光路稳定性。
2. 长期稳定性
- 每月进行一次全波长范围(200-1000 nm)的基线扫描，观察杂散光和波长重复性；
- 使用标准溶液周期性验证(如每周一次)，记录偏差趋势。
五、特殊注意事项
1. 基座清洁与维护
- 每次使用后用拭镜纸擦拭基座，防止残留蛋白或盐结晶影响液柱形成；
- 定期检查光纤探头是否磨损，避免光损失。
2. 环境控制
- 实验室温度需控制在20-25℃，湿度<60%，避免冷凝水干扰光学系统；
- 避开强电磁场(如离心机、微波炉)，防止信号噪声。
3. 溯源性与合规性
- 校准标准物质需具备NIST或ISO认证，确保量值传递可靠性；
- 若用于临床诊断或质检，需符合行业规范(如CLSI标准或药典要求)。
